Die Metabolomik-Analyse deckt Metabolitenveränderungen während des Einfrierens auf

Wissenschaftliche Berichte Band 13, Artikelnummer: 6022 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Angelica dahurica (Angelica dahurica Fisch. ex Hoffm.) wird häufig als traditionelle chinesische Medizin verwendet und die sekundären Metaboliten weisen erhebliche pharmakologische Aktivitäten auf. Es hat sich gezeigt, dass die Trocknung ein Schlüsselfaktor für den Cumaringehalt von Angelica dahurica ist. Der zugrunde liegende Mechanismus des Stoffwechsels ist jedoch unklar. Ziel dieser Studie war es, die wichtigsten differenziellen Metaboliten und Stoffwechselwege zu bestimmen, die mit diesem Phänomen zusammenhängen. Eine auf Flüssigkeitschromatographie mit Tandem-Massenspektrometrie (LC-MS/MS) basierende gezielte Metabolomics-Analyse wurde an Angelica dahurica durchgeführt, die gefriergetrocknet (– 80 °C/9 h) und ofengetrocknet (60 °C/10 h) war. Darüber hinaus wurden die gemeinsamen Stoffwechselwege gepaarter Vergleichsgruppen auf der Grundlage einer KEEG-Anreicherungsanalyse untersucht. Die Ergebnisse zeigten, dass 193 Metaboliten als wichtige Differenzmetaboliten identifiziert wurden, von denen die meisten durch Ofentrocknung hochreguliert wurden. Es zeigte sich auch, dass viele wichtige Inhalte der PAL-Signalwege verändert wurden. Diese Studie enthüllte die groß angelegten Rekombinationsereignisse von Metaboliten in Angelica dahurica. Zunächst identifizierten wir neben Cumarinen weitere aktive Sekundärmetaboliten, und ätherisches Öl wurde in Angelica dahurica signifikant angereichert. Wir haben die spezifischen Metabolitenveränderungen und den Mechanismus des Phänomens der Cumarin-Hochregulierung, die durch einen Temperaturanstieg verursacht wird, weiter untersucht. Diese Ergebnisse bieten eine theoretische Referenz für zukünftige Forschungen zur Zusammensetzung und Verarbeitungsmethode von Angelica dahurica.

Angelica dahurica wird häufig in der traditionellen chinesischen Medizin verwendet und hat eine lange Geschichte, in der mehrere Sorten dokumentiert sind. Es ist allgemein anerkannt, dass die Funktionen und Aromen von Angelica dahurica hauptsächlich durch Inhaltsstoffe wie Cumarin, ätherisches Öl und Polysaccharid bestimmt werden. Wichtig ist, dass Cumarin mit antibakteriellen, entzündungshemmenden und krebsbekämpfenden Wirkungen in Verbindung gebracht wird1. Flüchtige Öle und Polysaccharide sind für die entzündungshemmenden, schmerzstillenden und antioxidativen Eigenschaften verantwortlich2. Zusätzlich zu seinen medizinischen Zwecken wird Angelica dahurica als Rohstoff für Kosmetika und Aromastoffe3 verwendet.

Nach dem Sammeln frischer chinesischer Arzneimittel müssen die nichtmedizinischen Teile rechtzeitig entfernt und die Reste getrocknet werden. Die optimale Trocknungsmethode und die optimalen Trocknungsbedingungen können möglicherweise die chemische Umwandlung und Biotransformation der chemischen Substanzen zur Extraktion der medizinischen Komponenten fördern und den Weg für eine gute klinische Wirksamkeit ebnen4. Es wird allgemein angenommen, dass das Trocknen die Qualität der chinesischen Medizin direkt beeinträchtigen kann. Die beiden in dieser Studie verwendeten Trocknungsansätze waren Ofentrocknung und Gefriertrocknung. Interessanterweise nutzt die Vakuum-Gefriertrocknungstechnologie hauptsächlich die Prinzipien der Wassersublimation5. Es handelt sich um eine Trocknungsmethode, die Eis direkt in Wasserdampf umwandelt, um ungebundenes Wasser zu entfernen6. Im Gegensatz dazu ist die Ofentrocknung eine Methode der künstlichen Erwärmung, bei der Materialien in einen Ofen, einen Trockenraum oder einen Trockner usw. gelegt werden.7. Dementsprechend können Trocknungstemperatur und -zeit entsprechend den Eigenschaften verschiedener medizinischer Materialien gesteuert werden.

Frühere Studien zu Angelica dahurica legten besonderen Wert auf spezifische Trocknungsmethoden, -verfahren und -geräte. Um verschiedene Trocknungsprozesse zu vergleichen und die beste Trocknungsmethode und die besten Schlüsselparameter zu ermitteln, waren Erfahrung und viele sich wiederholende Experimente erforderlich. Die Forschung auf molekularer Ebene zur Verarbeitung von Angelica dahurica ist jedoch noch weitgehend unerforscht. Pei L. et al. untersuchte den Einfluss und die Veränderung der chemischen Bestandteile von Cumarin und ätherischem Öl in Angelica dahurica; Interessanterweise lieferte das Schälen und Trocknen mit Heißluft bei 60 °C die besten Ergebnisse, gefolgt vom Schälen und Trocknen mit Heißluft bei 40 °C und der Gefriertrocknung8. In ähnlicher Weise haben Jie J. et al. berichteten, dass der Cumaringehalt in Angelica dahurica beim Trocknen bei 60 °C höher war als bei 40 °C9. Eine Studie, in der die Bestandteile von Cumarin in Imperatorin (Verbindungs-CID: 10212) und Isoimperatorin (Verbindungs-CID: 68081) gemessen wurden (Ergänzungstabelle S4), ergab die besten Ergebnisse beim Trocknen bei 60 °C, gefolgt von Trocknen bei 80 °C und 25 °C10 . Aktuelle Erkenntnisse deuten darauf hin, dass der Gehalt an Cumarin in Angelica dahurica zu Beginn ansteigt und dann mit der Verarbeitungstemperatur abnimmt, mit einem Spitzenwert bei 60 °C. Dementsprechend haben wir für die Forschung die Trocknungstemperatur von 60 °C gewählt. Es wurde festgestellt, dass aufgrund der thermischen Instabilität der Gehalt an Arzneimittelkomponenten bei hohen Temperaturen (> 70 °C) sinkt. Allerdings ist der Mechanismus, der der Hochregulierung der medizinischen Bestandteile von Angelica dahurica in Abhängigkeit von der Temperatur zugrunde liegt, noch nicht geklärt.

In den letzten Jahren wurde die Metabolomanalyse auf die biologische Forschung angewendet, vom physiologischen Stoffwechsel in Pflanzen bis zur Entwicklung persönlicher Metabolomik, und ihre Anwendung trägt zu einem besseren Verständnis der komplexen molekularen Wechselwirkungen innerhalb biologischer Systeme bei11. Es wurde dokumentiert, dass die weitreichend zielgerichtete Metabolomik die Vorteile von Nicht-Ziel- und zielgerichteten Metabolitenerkennungstechnologien vereint und eine hohe Empfindlichkeit und eine breite Abdeckung aufweist12. Durch die Charakterisierung der Stoffwechselprofile von Angelica dahurica, die in Lyophilisatoren und Trocknern getrocknet werden, ist es daher möglich, einen mechanistischen Zusammenhang zwischen Veränderungen im Stoffwechsel von Angelica dahurica und dem Phänomen der durch Temperaturerhöhungen verursachten Cumarin-Hochregulierung herzustellen.

In dieser Studie wurde eine gezielte Metabolomik eingesetzt, um erstmals die Stoffwechselprofile zwischen Ofentrocknung und Gefriertrocknung von Angelica dahurica zu vergleichen und so das Phänomen der durch erhöhte Temperaturen verursachten Cumarin-Hochregulierung zu verstehen. Dies ist die erste Studie, die groß angelegte Rekombinationsereignisse von Metaboliten in Angelica dahurica aufdeckt und einen umfassenden Überblick über den Mechanismus bietet, der der durch Temperaturerhöhungen verursachten Hochregulierung von Cumarin zugrunde liegt.

Aus den Eigenschaften der gefriergetrockneten (Abb. 1A) und ofengetrockneten (Abb. 1B) Stücke lässt sich erkennen, dass die ofengetrockneten Stücke eine lockerere Textur, eine dunklere Farbe und einen größeren Ölgehalt aufwiesen Drüsen. Die Ölkammer stellt eine Gruppe von Zellen mit Sekretionsvermögen dar. In der Ölkammer wurden große Mengen pflanzlicher Metaboliten gelagert, was darauf hindeutet, dass sich nach der Ofentrocknung mehr Metaboliten ansammelten als nach der Gefriertrocknung, und es wurde spekuliert, dass der Cumaringehalt mit zunehmender Temperatur ebenfalls zunahm.

Ofengetrocknete und gefriergetrocknete Stücke von Angelica dahurica. (A) Gefriertrocknungsstücke; (B) Stücke im Ofen trocknen.

Die Massenspektraldaten wurden mit der Software Analyst 1.6.3 verarbeitet. Die Metaboliten der Proben wurden mittels Massenspektrometrie auf der Grundlage der lokalen Stoffwechseldatenbank qualitativ und quantitativ analysiert. Wie in der Abbildung (Ergänzungsabbildung S2) gezeigt, ist die MRM-Metaboliten-Detektionspeakkarte (Multi-Substanz-Extraktions-Ionenchromatogramm, XIC) dargestellt. Es zeigt die Substanzen, die in der Probe nachgewiesen werden können, und jeder Peak im Massenspektrum in verschiedenen Farben repräsentiert einen nachgewiesenen Metaboliten. Die charakteristischen Ionen jeder Substanz werden durch einen Dreifachquadrupol herausgefiltert, die Signalintensität (CPS) der charakteristischen Ionen wird im Detektor ermittelt, die Massenspektrumdatei der Probe wird mit der Software MultiaQuant 3.0.3 geöffnet und die Integration und Korrektur erfolgt der chromatographischen Peaks durchgeführt. Die Peakfläche (Area) des Peaks stellt den relativen Gehalt der entsprechenden Substanz dar. Abschließend werden alle chromatographischen Peakflächenintegrationsdaten exportiert und gespeichert.

Um die Metabolitenveränderungen in Angelica dahurica nach Lyophilisierung und Trocknung besser zu verstehen, wurden die primären und sekundären Metaboliten in den Proben mit der UPLC-MS-Plattform identifiziert. Im Experiment wurden insgesamt 995 Metaboliten nachgewiesen, aufgeteilt in 28 Klassen, darunter Aminosäuren und Derivate (n = 97), Phenolsäuren (n = 143), Nukleotide und Derivate (n = 59), Chalkone (n = 6), Aurone (n = 1), Flavanone (n = 13), Flavanonole (n = 5), Anthocyanidine (n = 6), Flavone (n = 25), Flavonole (n = 25), Flavonoidcarbonosid (n = 2), Flavanole (n = 3), Isoflavone (n = 9), Chinone (n = 4), Lignane (n = 18), Cumarine (n = 92), Saccharide und Alkohole (n = 62), Vitamin (n = 16) , Alkaloide (n = 88), Terpenoide (n = 40), organische Säuren (n = 81), Glycerinester (n = 18), PC (n = 1), Sphingolipide (n = 2), LPC (n = 33 ), LPE (n = 22), freie Fettsäuren (n = 73) und andere (n = 51). Unter diesen Differenzialmetaboliten waren Aminosäuren und Derivate (9,75 %), Phenolsäuren (14,37 %), Cumarine (9,25 %), Alkaloide (8,84 %), organische Säuren (8,14 %) und freie Fettsäuren (7,34 %) am häufigsten reichlich vorhanden (Abb. 2C).

(A) PCA-Score-Diagramm der Metaboliten in TYH, TYD, TJXH und TJXD; (B) Heatmap der Metaboliten in TYH, TYD, TJXH und TJXD; (C) Klassifizierung der 995 Metaboliten von Angelica dahurica-Proben.

Die PCA aller Behandlungen in den vier Gruppenproben (Abb. 2A) zeigte, dass die Angelica dahurica bei verschiedenen Trocknungsansätzen getrennt wurde, was darauf hinwies, dass die Stoffwechselunterschiede deutlich waren. Hauptkomponente 1 (PC1) und Hauptkomponente 2 (PC2) machten 44,32 % bzw. 26,75 % der Varianz in den Daten aus. Diese Ergebnisse zeigten, dass Ofentrocknungs- und Gefriertrocknungsbehandlungen für Unterschiede in den Metaboliten von PC1 verantwortlich waren und die Gruppen aus verschiedenen Plantagenstandorten hauptsächlich durch PC2 getrennt waren.

Die Cluster-Heatmap der Metaboliten in allen Proben ist in Abb. 2B dargestellt. Einige Metaboliten von Angelica dahurica wurden bei der Behandlung in einem Trockenofen hochreguliert, in einem Lyophilisator jedoch herunterreguliert, was auf signifikante Unterschiede bei den Metaboliten zwischen Ofentrocknung und Gefriertrocknung schließen lässt. Die Hochregulierung des „Inhalts“ ist keine absolute Zunahme oder Abnahme, sondern eine relative Zunahme oder Abnahme. Wenn beim Screening differenzieller Metaboliten die Gruppierungsinformationen A vs. B lauten, bedeutet dies, dass A die Kontrollgruppe und B die Versuchsgruppe für die Datenanalyse ist. Wenn das endgültige Screening der Differenzialmetaboliten hochreguliert wird, bedeutet dies, dass der Gehalt an Metaboliten in A relativ niedrig und in B relativ hoch ist. Es wurden vier Hauptcluster erhalten. Die Cluster 1 und 2 häuften sich in TYD und TJXD in hohem Maße an. Die Cluster 3 und 4 akkumulierten in TYH und TJXH in hohem Maße. Darüber hinaus wurden die drei biologischen Replikationen jeder Gruppe zusammengefasst, was auf eine gute Homogenität zwischen den Duplikaten und die hohe Zuverlässigkeit der Daten hinweist.

Die OPLS-DA-Analyse ist eine multivariate statistische Analyse mit überwachter Mustererkennung, die irrelevante Effekte beim Screening differenzieller Metaboliten effektiv eliminieren kann. Im OPLS-DA-Score-Diagramm (Abb. 3C) waren die TYD-Proben auf der linken Seite des Konfidenzintervalls verteilt, während die TYH-Proben auf der rechten Seite verteilt waren. Der Kernwert der Hauptkomponente im OSC-Prozess (T-Score [1]) betrug 76,8 %. Der orthogonale T-Score [1] im OSC-Verfahren betrug 5,49 %. Die Vorhersageparameter des Bewertungsmodells sind R2X, R2Y und Q2. R2X und R2Y repräsentieren die Interpretationsrate der X- bzw. Y-Matrizen des erstellten Modells, und Q2 repräsentiert die Vorhersagefähigkeit des Modells. Je näher diese drei Indikatoren bei 1 liegen, desto stabiler ist das Modell. Während der Modellüberprüfung (n = 200, d. h. 200 Permutationsexperimente) von OPLS-DA (Abb. 3D) gilt Q2 = 0,994 > 0,9, R2Y = 1, R2X = 0,822, P < 0,005. In ähnlicher Weise waren in einem anderen OPLS-DA-Score-Diagramm (Abb. 3A) die TJXD- und TJXH-Proben klar getrennt und während der Modellüberprüfung (Abb. 3B) war Q2 = 0,98 > 0,9, R2Y = 1, R2X = 0,743, P < 0,005 zeigte weiter an, dass zwei Modelle beide zuverlässig waren.

Die Score-Plots der paarweisen OPLS-DA-Vergleiche unterschiedlicher Metaboliten: (A) TJXD vs. TJXH, (C) TYD vs. TYH; Modellverifizierungsdiagramm: (B) TJXD vs. TJXH, (D) TYD vs. TYH.

Die Differenzialmetaboliten von TYD vs. TYH und TJXD vs. TJXH wurden zunächst mit OPLS-DA gescreent. Der Fold-Change-Wert und der VIP-Wert wurden umfassend zum Screening der Differenzmetaboliten verwendet. Metaboliten mit einer Fold Change ≥ 2, einer Fold Change ≤ 0,5 und einem VIP ≥ 1 wurden als signifikante Differentialmetaboliten ausgewählt. Das Vulkandiagramm in Abb. 4A, B lässt auf einen signifikanten Unterschied bei den unterschiedlichen Metaboliten schließen, was die Zuverlässigkeit der Ergebnisse weiter bestätigt. Für TJXD vs. TJXH wurden 258 (210 hochregulierte und 48 herunterregulierte) Differenzialmetaboliten erhalten. Für TYD vs. TYH wurden 417 (264 hochregulierte und 153 herunterregulierte) als differenzielle Metaboliten identifiziert. Wie in der ergänzenden Abbildung S1 gezeigt, wurden für beide Gruppen bei der Ofentrocknung mehr Metaboliten hochreguliert als bei der Gefriertrocknung, was darauf hindeutet, dass physiologische und biochemische Reaktionen durch die Ofentrocknung gefördert wurden. Wie in der Ergänzungstabelle S1 gezeigt, wurden die Metaboliten für ausgewählte TJXD- und TJXH-Metaboliten in 10 Hauptklassen und 28 Unterklassen eingeteilt, darunter Aminosäuren und Derivate (n = 27), Phenolsäuren (n = 45), Nukleotide und Derivate (n). = 32), Flavonoide (n = 13), Lignane und Cumarine (n = 12), Alkaloide (n = 24), Terpenoide (n = 4), organische Säuren (n = 24), Lipide (n = 55) und andere (n = 22). Die ausgewählten Metaboliten für TYD vs. TYH wurden in 10 Hauptkategorien und 36 Unterkategorien eingeteilt, darunter Aminosäuren und Derivate (n = 32), Phenolsäuren (n = 63), Nukleotide und Derivate (n = 49), Flavonoide (n = 51), Chinone (n = 1), Lignane und Cumarine (n = 28), Alkaloide (n = 44), Terpenoide (n = 8), organische Säuren (n = 32), Lipide (n = 55) und andere ( n = 34). Unsere Ergebnisse deuten darauf hin, dass es in TY mehr Arten von Differenzialmetaboliten gibt als in TJX, insbesondere Alkaloide und Flavonoide, die auf die unterschiedlichen Plantagenbasen zurückzuführen sein könnten.

Vulkandiagramm der Metaboliten: (A) TJXD vs. TJXH, (B) TYD vs. TYH.

Die erfolgreiche Identifizierung gemeinsamer Differenzialmetaboliten könnte dabei helfen, die physiologischen und biochemischen Reaktionen von Angelica dahurica während des Trocknens herauszufinden. Wir haben diese Daten basierend auf den beiden zuvor erwähnten Sätzen unterschiedlicher Metaboliten kombiniert und gefiltert. Zwischen beiden Gruppen wurden 193 gemeinsame Differenzialmetaboliten erhalten (Ergänzungstabelle S2). Von diesen Differenzialmetaboliten waren 158 hochreguliert und 35 herunterreguliert, was darauf hindeutet, dass einige wichtige physiologische Metaboliten und Stoffwechselaktivitäten während der Ofentrocknung aktiviert werden könnten.

Diese Metaboliten wurden in 10 Hauptklassen und 24 Unterklassen eingeteilt, darunter Aminosäuren und Derivate (n = 25), Nukleotide und Derivate (n = 32), Phenolsäuren (n = 32), Flavonoide (n = 12), Lignane und Cumarine (n = 7), Alkaloide (n = 21), organische Säuren (n = 21), Lipide (n = 25), Terpenoide (n = 1) und andere (n = 13). Unter diesen Metaboliten waren Aminosäuren und Derivate, Nukleotide und Derivate, Lipide und organische Säuren die primären pflanzlichen Metaboliten, während Phenolsäuren, Flavonoide, Lignane und Cumarine, Alkaloide und Terpenoide die sekundären Metaboliten waren. Wie in Abb. 5 gezeigt, waren diese unterschiedlich exprimierten Metaboliten in Aminosäuren und Derivaten, Phenolsäuren, Nukleotiden und Derivaten sowie organischen Säuren konzentriert. Paarweise Vergleiche zeigten, dass die Anzahl der hochregulierten Metaboliten signifikant höher war als die der herunterregulierten Metaboliten. Darüber hinaus war die Anzahl der sekundären Metaboliten beim Trocknen im Ofen höher als beim Gefriertrocknen, was darauf hindeutet, dass die physiologischen und biochemischen Reaktionen von Angelica dahurica unter Hitze denen von Angelica dahurica unter biologischem oder abiotischem Stress ähnelten. Darüber hinaus wurden sieben Lignane und Cumarine während der Ofentrocknung alle hochreguliert, was mit der Literatur übereinstimmt.

Klassifizierung häufiger Differenzialmetaboliten zwischen den Gruppen TYD vs. TYH und TJXD vs. TJXH.

Alle differenziellen Metaboliten in paarweisen Vergleichsgruppen wurden mit der KEGG-Datenbank (www.kegg.jp/kegg/kegg1.html) abgeglichen, um Informationen zum Stoffwechselweg zu erhalten. Es wurden KEGG-Annotationen und Anreicherungsanalysen durchgeführt. Die angereicherten Pfade sind in Abb. 6A und B dargestellt. Für TJXD vs. TJXH bestanden die angereicherten Stoffwechselwege dieser unterschiedlichen Metaboliten aus Tyrosinstoffwechsel, Tryptophanstoffwechsel, Pyrimidinstoffwechsel, Purinstoffwechsel, Phenylpropanoidbiosynthese, Phenylalaninstoffwechsel und Linolsäurestoffwechsel. Für TYD vs. TYH umfassten die angereicherten Wege der differentiellen Metaboliten den Pyrimidin-Metabolismus, den Purin-Metabolismus, den Phenylalanin-Metabolismus, den Lysin-Abbau und den Glutathion-Metabolismus. Die Kreuzung ergab den Pyrimidin-, Purin- und Phenylalanin-Metabolismus als deutlich angereicherte Wege für diese unterschiedlichen Metaboliten. Der Purin- und Pyrimidinstoffwechsel ist an der Synthese von Vorläufermaterialien beteiligt, die für die nachgelagerte Synthese wesentlich sind. Insbesondere werden Purin- und Pyrimidinbasen während des Purin- und Pyrimidinstoffwechsels produziert und sind Grundmaterialien für die Synthese von Nukleotiden. Nukleotide sind essentielle Zellbestandteile, die eine wichtige Rolle beim Wachstum, der Entwicklung, dem Stoffwechsel und der Synthese anderer Substanzen von Pflanzen spielen. Darüber hinaus ist der Purin- und Pyrimidinstoffwechsel für den primären und sekundären Pflanzenstoffwechsel erforderlich13,14. Beispielsweise wurde Uridin-Diphosphat (UDP) (Verbindungs-CID: 6031) während des Pyrimidin-Metabolismus produziert (Abb. 6C). Unter der Katalyse der Saccharose-Synthase reagierten Saccharose und UDP reversibel zu Fructose und UDP-Glucose. UDP-Glucose fungierte als Glucosyldonor bei der Derivatisierung von Sekundärmetaboliten und Hormonen in einer Vielzahl von Reaktionen, die durch die riesige Proteinfamilie der UDP-Glucose-Glycosyltransferasen katalysiert wurden. Xanthosin (Verbindungs-CID: 64959) wird während des Purinstoffwechsels produziert und ist an der Synthese von Alkaloiden wie Theobromin, Koffein usw. beteiligt (Ergänzungstabelle S4).

KEGG-Anmerkungen und Anreicherung unterschiedlich exprimierter Metaboliten: (A) TJXD vs. TJXH, (B) TYD vs. TYH; (C) Veränderungen in Schlüsselmetaboliten, die den Stoffwechselwegen in Angelica dahurica-Proben zugeordnet sind. Hinweis: Das rote kleine Rechteck zeigt an, dass der Metabolitengehalt deutlich hochreguliert ist; Das blaue kleine Rechteck zeigt an, dass der Metabolitengehalt deutlich herunterreguliert ist. Das weiße kleine Rechteck zeigt keinen signifikanten Unterschied in diesem Metabolitengehalt an.

Der Phenylalaninstoffwechsel ist einer der wichtigsten Wege für die Sekundärmetabolitensynthese in Pflanzen. Wir fanden heraus, dass Phenolsäuren, Flavonoide, Lignane und Cumarine sowie einige Alkaloide auf diesem Weg synthetisiert wurden (Abb. 6C). Phenylalanin (Verbindungs-CID: 6140) wurde durch Shikimisäure (Verbindungs-CID: 8742) synthetisiert. Unter der Wirkung von Phenylalanin-Ammoniak-Lyase (PAL) wird Phenylalanin in trans-Zimtsäure umgewandelt (Verbindungs-CID: 139054223). Anschließend wurde trans-Zimtsäure unter Einwirkung von Cinnamat-4-hydroxylase (C4H) auf P-Cumarsäure (Verbindungs-CID: 637542) übertragen (Ergänzungstabelle S4). Trans-Zimtsäure dient als wichtigste Vorläufersubstanz sekundärer Metaboliten. PAL und C4H gelten ebenfalls als zwei Kernenzyme.

Derzeit konzentriert sich die Forschung zur Zusammensetzung von Angelica dahurica hauptsächlich auf Cumarin und ätherisches Öl. In dieser Studie verwendeten wir eine breit angelegte Metabolomik15, die sich durch ihre hohe Empfindlichkeit, ihre genauen quantitativen und qualitativen Eigenschaften und ihre breite Abdeckung auszeichnet, um Metaboliten von Angelica dahurica in zwei Plantagenbasen nach zwei unterschiedlichen Trocknungsmethoden zu identifizieren. Im Vergleich zu anderen Untersuchungen zu den Auswirkungen verschiedener Trocknungsmethoden auf die Qualität von Angelica dahurica verwendeten wir Gefriertrocknung als Kontrollgruppe und Ofentrocknung als Versuchsgruppe, um die unterschiedlichen Metaboliten aufzudecken, die bei den beiden Trocknungsmethoden entstehen, mit dem Ziel, Cumarin zu untersuchen Veränderungen bei Angelica dahurica mit der Temperatur aus Sicht des Stoffwechsels. Wir haben 995 Metaboliten untersucht, von denen 27 in jeder der vier Gruppen unter den Top 50 waren (Ergänzungstabelle S3). Die meisten sekundären Metaboliten gehören zur Cumarin-Klasse, mit Ausnahme der primären Metaboliten, die die normalen Aktivitäten des Organismus aufrechterhalten. Weitere Klassen sekundärer Metaboliten wurden identifiziert. Beispielsweise wurde Pterolactam (Compound CID: 181561), isoliert aus Chrysanthemum coronarium L. und Rhizom von Coniogramme japonica, zu den Pyrrolalkaloiden gezählt und neuere Studien haben gezeigt, dass es eine antimikrobielle Aktivität aufweist. Anca-Elena Dascalu et al. untersuchten die antimykotischen Aktivitäten von Pterolactam an einer Gruppe von neun Pilzstämmen und drei Nicht-Albicans-Candida-Hefearten16,17,18. L-Pipecolinsäure (Verbindungs-CID: 439.227) ist ein Zwischenprodukt des L-Lysin-Katabolismus und seine zentrale Injektion soll eine hypnotische Wirkung auf das Gehirn haben19. Darüber hinaus spielt es eine wichtige Rolle bei medizinischen Fragen, der Ökologie der Rhizosphäre, der Dekontamination verschmutzter Böden, der Nährstoffaufnahme und der Pflanzenresistenz20,21,22,23. Gleichzeitig gab es in Angelica dahurica neben Cumarin und ätherischem Öl noch einige andere Sekundärmetaboliten mit hohem Gehalt, pharmakologischen Wirkungen und hohem Anwendungswert. Diese Studie bietet eine theoretische Referenz für zukünftige Forschungen zu anderen Substanzen in Angelica dahurica (Ergänzungstabelle S4).

Es wurde festgestellt, dass eine breit angelegte Metabolomanalyse den quantitativen Nachweis von etwa tausend Metaboliten gleichzeitig ermöglicht, was einem umfassenden und effektiven Vergleich von Metabolitenunterschieden und der Analyse von Stoffwechselwegen dient24. Die Analyse der differenziellen Metaboliten ergab 193 differenzielle Metaboliten, die in 10 Hauptklassen eingeteilt wurden. Von diesen Differenzialmetaboliten waren 158 hochreguliert und 35 herunterreguliert. In Lipiden wurden die Fettsäuren hochreguliert, der Glycerinester, der aus Linoleat und Linolenat besteht, jedoch herunterreguliert. Die Erhöhung des Sättigungsgrads der Fettsäuren wirkt sich positiv auf die Aufrechterhaltung der Membranstabilität und Hitzetoleranz aus, da ein größerer Anteil gesättigter Fettsäuren zu einer höheren Lipidschmelztemperatur führen und einen hitzebedingten Anstieg der Membranfließfähigkeit verhindern könnte25. Linoleat und Linolenat sind die wichtigsten Fettsäuren in Pflanzenmembranen26. Daher spekulieren wir, dass mit einer Erhöhung der Verarbeitungstemperatur der Linoleat- und Linolenatgehalt sinken würde, nachdem die Zellmembran von Angelica dahurica beschädigt wurde, während eine Erhöhung des Fettsäuregehalts eine durch Hitze verursachte erhöhte Membranflüssigkeit verhindern könnte. Darüber hinaus war Cumarin im Einklang mit der Literatur hochreguliert. Basierend auf den KEGG-Annotations- und Anreicherungsergebnissen wurden drei Stoffwechselwege diesen überlappenden Differenzialmetaboliten zugeordnet, nämlich Pyrimidin-Metabolismus, Purin-Metabolismus und Phenylalanin-Metabolismus. Da der Purin- und Pyrimidin-Metabolismus an der Synthese vorgelagerter Substanzen beteiligt ist, haben wir als Nächstes den Phenylalanin-Metabolismus besprochen.

Berichten zufolge erzeugt der Biosyntheseweg von Phenylpropanoid, einem der wichtigsten Sekundärmetaboliten in Pflanzen unter abiotischem oder biotischem Stress, zahlreiche Antioxidantien, darunter Flavonoide, Lignane und Phenole, um Pflanzen vor Angriffen zu schützen27,28. Es wurde festgestellt, dass UV-C-Bestrahlung die Genexpression des Phenylpropanoid-Signalwegs in Süßkirschen (Prunus avium L.) erhöht29. In dieser Studie wurde die Phenylpropanoid-Biosynthese bei erhöhter Temperatur deutlich gesteigert. Bei Phenolsäuren waren die ersten und zweiten Metaboliten und ihre Derivate von Phenylalanin erhöht, wie z. B. Zimtsäure, p-Cumarsäure, p-Cumaraldehyd, p-Cumarylalkohol, Hydrozimtsäure, 2-Hydroxyzimtsäure und 4-Methoxyzimtsäure belegten die Aktivierung des Phenylalaninweges und stellten Vorläufersubstanzen für die Steigerung von Flavonoiden, Cumarin und Lignin bereit. Es ist möglicherweise mit der Aktivierung von PAL und C4H30,31 verbunden. Darüber hinaus sollen andere angereicherte Phenolsäuren, wie z. B. Gallussäure (Compound CID: 370), ein krebsbekämpfendes, entzündungshemmendes und hepatoprotektives Potenzial haben32. Flavonoide wirken als Fänger freier Radikale, Reduktionsmittel, Wasserstoffspender und Singulett-Sauerstofflöscher und weisen hohe antioxidative Eigenschaften auf33. Kaempferol-3-O-glucosid (Verbindungs-CID: 5282102) und Catechin-5-O-glucosid (Verbindungs-CID: 44257081) sind zwei Arten von Flavonoiden, von denen gut dokumentiert ist, dass sie eine starke antioxidative Aktivität34 haben, die deutlich erhöht war und dazu beitrug, der Oxidation zu widerstehen Erwärmung in der vorliegenden Studie (Ergänzungstabelle S4).

In unserer Studie wurden Cumarin und Lignin alle hochreguliert und werden durch den Phenylalaninstoffwechsel erzeugt. Der Phenylalanin-Stoffwechselweg ist eine enzymatische Reaktion und PAL ist das zentrale Enzym des Phenylalanin-Stoffwechsels. Unter normalen Umständen ist die PAL-Expression in Pflanzen gering und nimmt normalerweise als Reaktion auf biotischen oder abiotischen Stress wie hohe Temperaturen, mechanische Schäden usw. zu. Daraus lässt sich vernünftigerweise ableiten, dass PAL während der Hitzetrocknung von Angelica dahurica aktiviert wird und Phenylalanin fördert Stoffwechsel und Erhöhung des Gehalts an Cumarinen und Lignanen35. Cumarin gilt als wichtigste pharmakologische Substanz von Angelica dahurica. Deutlich erhöhte Cumarine unter den Differenzialmetaboliten haben bestimmte pharmakologische Wirkungen, wie z. B. Scoparon (Verbindungs-CID: 8417) (Ergänzungstabelle S4), das zuvor zur Verringerung der proliferativen Reaktionen menschlicher peripherer mononukleärer Zellen, zur Entspannung der glatten Muskulatur, zur Senkung des Gesamtcholesterins und der Triglyceride usw. nachgewiesen wurde verzögern die charakteristischen pathomorphologischen Veränderungen bei Kaninchen mit Hypercholesterinämie und Diabetes36. Das Psoralen-Derivat Methoxsalen hat eine gute heilende Wirkung bei Psoriasis und anderen Dermatosen37. Die beobachtete Hochregulierung von Cumarinen steht im Einklang mit der Literatur, und die Analyse der hochregulierten Cumarine ermöglicht die Identifizierung des optimalen Trocknungsansatzes für Angelica dahurica. Lignin entsteht durch die oxidative Kupplung von Monolignolen, die über den Phenylpropanoid-Weg synthetisiert werden. Es ist ein wesentlicher Bestandteil der sekundären Zellwand von Pflanzen und stärkt die Zellstruktur. Daraus schließen wir, dass die Anreicherung von Lignin mit der Widerstandsfähigkeit gegen hohe Temperaturen zusammenhängt38,39.

Zusätzlich zu den signifikanten Unterschieden bei den durch den Phenylalanin-Weg erzeugten Sekundärmetaboliten wurden 21 Alkaloidkomponenten signifikant verändert, von denen 19 hochreguliert waren. Alkaloide werden durch eine Vielzahl biochemischer Reaktionen aus Aminosäuren gebildet. Die veränderten Alkaloide stammen hauptsächlich aus dem Tryptophan-, Phenylalanin- und Ornithin-Metabolismus, was mit den unterschiedlichen Metaboliten von Aminosäureverbindungen übereinstimmt. Es ist ersichtlich, dass der Aminosäurestoffwechsel ein Weg der Proteinsynthese ist, als Zwischenprodukt für einige Metaboliten fungiert und an der Regulierung verschiedener Stoffwechselwege beteiligt ist, wodurch viele physiologische Prozesse in Pflanzen beeinflusst werden. Darüber hinaus weisen hochregulierte Alkaloide wie Betain und Norgalanthamin zahlreiche pharmakologische Aktivitäten auf40.

Diese Studie weist noch einige Einschränkungen auf. Es ist allgemein anerkannt, dass das pflanzliche Metabolom aus über 200.000 Metaboliten besteht, die die Pflanzenentwicklung steuern, und sogar Arabidopsis enthält 5.000 Metaboliten41. Dementsprechend besteht Angelica dahurica aus mehr als 995 Metaboliten, die in der vorliegenden Studie identifiziert wurden. Diese Diskrepanz kann auf das Fehlen großer öffentlicher Metabolitendatenbanken für Kräutermedizin zurückgeführt werden. Darüber hinaus ist ein weiterer Hauptwirkstoff von Angelica dahurica ätherisches Öl; Allerdings hat die UPLC-MS/MS-Analyse nur einen begrenzten Wert für den Nachweis flüchtiger Öle. In zukünftigen Forschungen sollte das Metabolom von Angelica dahurica mit Schwerpunkt auf ätherischen Ölen analysiert werden. Weitere Studien sind erforderlich, um zu überprüfen, ob PAL, 4-Cumarat-CoA-Ligase (4CL) und C4H-Enzyme eine Schlüsselrolle bei der Aktivierung des Phenylpropanoidwegs spielen. Insgesamt liefert diese Studie eine theoretische Referenz für die Erforschung anderer Substanzen in Angelica dahurica und bestätigt, dass Cumarin bei erhöhter Temperatur innerhalb eines bestimmten Bereichs während der Verarbeitung verstärkt wird, was neue Erkenntnisse über die Qualität von Angelica dahurica für die klinische Anwendung liefert.

Die Pflanzenmaterialien wurden in Suining, Sichuan, China, auf verschiedenen Pflanzfeldern in der Region Tai Yi (TY) und Tang Jia Xiang (TJX) geerntet und von Jin Pei, Professor der Chengdu-Universität für Traditionelle Chinesische Medizin, als Angelica dahurica identifiziert und in der nationalen Keimplasma-Ressourcenbank der traditionellen chinesischen Medizin aufbewahrt. Anschließend wurden die Versuchsmaterialien aus den beiden Bereichen bei 60 °C gefriergetrocknet und im Ofen getrocknet. Alle gesammelten Proben wurden in vier Gruppen eingeteilt: TY und Ofentrocknung (TYH), TXJ und Ofentrocknung (TJXH), TY und Gefriertrocknung (TYD) und TJX und Gefriertrocknung (TJXD). Die Proben wurden nach der Ernte gleichmäßig auf die vier Gruppen verteilt und für jedes Experiment wurden drei Wiederholungen durchgeführt.

Die Sammlung von Angelica dahurica in dieser Studie entspricht der Grundsatzerklärung der IUCN zur Forschung zu vom Aussterben bedrohten Arten und dem Übereinkommen über den Handel mit gefährdeten Arten freilebender Tiere und Pflanzen. Darüber hinaus ist Angelica dahurica, das Versuchsmaterial dieser Studie, laut der vom Staatlichen Forst- und Grünlandamt Chinas herausgegebenen Liste der national wichtigsten geschützten Wildpflanzen weder eine gefährdete Pflanzenart noch eine national wichtige geschützte Wildpflanze. Außerdem haben wir die Erlaubnis zur Pflanzensammlung von Sichuan Suining Quantaitang Pharmaceutical Co., Ltd. erhalten.

Verwandte Experimente wie die Probenvorbereitung und die Extraktion von Metaboliten wurden von Wuhan Maitville Biotechnology Co., Ltd. durchgeführt. Biologische Proben wurden mit einem Vakuum-Gefriertrockner (Scientz-100F) gefriergetrocknet und mit einem Ofen (DHG-9140A) hitzegetrocknet. Die Proben wurden mit einer Schwingmühle (MM 400, Retsch) mit einer Zirkonoxidperle 1,5 min bei 30 Hz zerkleinert. 100 mg Pulver wurden mit 1,2 ml 70 %iger Methanollösung gelöst und alle 30 Minuten insgesamt 6 Mal 30 Sekunden lang verwirbelt. Die Proben wurden über Nacht bei 4 °C in einen Kühlschrank gestellt. Nach 10-minütiger Zentrifugation bei 12.000 U/min wurden die Extrakte vor der UPLC-MS/MS-Analyse filtriert (SCAA-104, 0,22 μm Porengröße; ANPEL, Shanghai, China, (http://www.anpel.com.cn/). .

Die Probenextrakte wurden mit einem UPLC-ESI-MS/MS-System analysiert (UPLC, SHIMADZU Nexera X2, (https://www.shimadzu.com.cn/); MS, Applied Biosystems 4500 Q TRAP, (https:// www.thermofisher.cn/cn/zh/home/brands/applied-biosystems.html). Die analytischen Bedingungen waren wie folgt, UPLC: Säule, Agilent SB-C18 (1,8 µm, 2,1 mm * 100 mm). Die mobile Phase bestand aus Lösungsmittel A, reinem Wasser mit 0,1 % Ameisensäure, und Lösungsmittel B, Acetonitril mit 0,1 % Ameisensäure. Das Gradientenprogramm war wie folgt: 95:5 V/V bei 0 min, 5:95 V/V bei 11,0 min , 5:95 V/V bei 12,0 Min., 95:5 V/V bei 12,1 Min. Anschließend wurde die Zusammensetzung innerhalb von 1,1 Min. auf 95 % A und 5,0 % B eingestellt und 2,9 Min. gehalten. Die Fließgeschwindigkeit wurde wie folgt eingestellt 0,35 ml pro Minute. Der Säulenofen hatte eine Temperatur von 40 °C und das Injektionsvolumen betrug 4 μl. Der Abfluss wurde alternativ an eine ESI-Triple Quadrupol-Linear-Ionenfalle (QTRAP)-MS angeschlossen.

Die Betriebsparameter der ESI-Quelle waren wie folgt: eine Ionenquelle, Turbospray; Quellentemperatur 550 °C; Ionensprühspannung (IS) 5500 V (positiver Ionenmodus)/-4500 V (negativer Ionenmodus); Ionenquellengas I (GSI), Gas II (GSII) und Vorhanggas (CUR) wurden auf 50, 60 bzw. 25,0 psi eingestellt; die kollisionsaktivierte Dissoziation (CAD) war hoch. QQQ-Scans wurden als MRM-Experimente mit auf mittel eingestelltem Kollisionsgas (Stickstoff) aufgenommen. DP und CE für einzelne MRM-Übergänge wurden mit weiterer DP- und CE-Optimierung durchgeführt. Für jeden Zeitraum wurde ein spezifischer Satz von MRM-Übergängen entsprechend den innerhalb dieses Zeitraums eluierten Metaboliten überwacht.

Die Analyse der Metabolitenstruktur basierte auf der selbst erstellten Datenbank HWDB. Die mittels Massenspektrometrie erfassten Primär- und Sekundärspektren wurden qualitativ analysiert und bei der Analyse einiger Substanzen wurden Isotopensignale entfernt, darunter wiederholte Signale von K + -Ionen, Na + -Ionen, NH 4 + -Ionen und Fragmentionen, die selbst größer waren Molekulargewichtssubstanzen, die das Signal wiederholen.

Die Quantifizierung der Metaboliten erfolgte über den MRM-Modus des QQQ-Massenspektrometers.

Zur Verarbeitung der Stoffwechseldaten wurden verschiedene statistische Analysemethoden verwendet, darunter die Hauptkomponentenanalyse (PCA), die hierarchische Clusteranalyse (HCA) und die orthogonale partielle Diskriminanzanalyse der kleinsten Quadrate (OPLS-DA). PCA wurde von der R-Funktion „prcomp“ (www.r-project.org) durchgeführt. Die HCA-Ergebnisse von Proben und Metaboliten wurden als Heatmaps mit Dendrogrammen dargestellt und mit dem R-Paket Complex Heatmap durchgeführt. Für HCA wurden normalisierte Signalintensitäten von Metaboliten (Einheitsvarianzskalierung) als Farbspektrum visualisiert. VIP-Werte wurden aus dem OPLS-DA-Ergebnis extrahiert, bestehend aus Score-Diagrammen und Permutationsdiagrammen, die mit Soft R erstellt wurden. Identifizierte Metaboliten wurden mithilfe der KEGG Compound-Datenbank (http://www.kegg.jp/kegg/compound/) mit Anmerkungen versehen. Annotierte Metaboliten wurden dann der KEGG-Datenbank (http://www.kegg.jp/kegg/pathway.html) zugeordnet.

Insgesamt wurden 995 Metaboliten in TYD, TYH, TJXD und TJXH nachgewiesen. Darunter befanden sich neben Cumarin und ätherischem Öl in Angelica dahurica noch weitere Sekundärmetaboliten mit hohem Gehalt, pharmakologischen Wirkungen und hohem Anwendungswert, die für zukünftige Forschungen genutzt werden können. Darüber hinaus wurden 193 Differenzialmetaboliten als wichtige Differenzialmetaboliten identifiziert, von denen die meisten durch Ofentrocknung hochreguliert wurden. Die KEEG-Annotations- und Anreicherungsanalyse zeigte, dass mäßiges Erhitzen den Phenylalanin-Weg fördern könnte, was zu einem erhöhten Cumaringehalt führt, und das etablierte potenzielle Metabolitennetzwerk offenbarte dieses Phänomen. Gleichzeitig führt die Aktivierung der Purin- und Pyrimidinwege zu einer Hochregulierung der meisten primären und sekundären Metaboliten, die von erheblichem Wert sind. Dennoch sind weitere Studien erforderlich, um zu überprüfen, ob PAL, 4-Cumarat-CoA-Ligase (4CL) und C4H Enzyme spielen eine Schlüsselrolle bei der Aktivierung des Phenylpropanoid-Signalwegs.

Die während der aktuellen Studie verwendeten und/oder analysierten Datensätze sind auf begründete Anfrage beim jeweiligen Autor erhältlich.

4-Cumarat-CoA-Ligase

Cinnamat-4-hydroxylase

Kollisionsaktivierte Dissoziation

Vorhanggas

Gas I

Gas II

Hierarchische Clusteranalyse

FlüssigkeitschromatographieTandem-Massenspektrometrie

Orthogonale partielle Diskriminanzanalyse der kleinsten Quadrate

Phenylalanin-Ammoniak-Lyase

Hauptbestandteil 1

Hauptbestandteil 2

Hauptkomponentenanalyse

Quadrupollineare Ionenfalle

Uridin-Diphosphat

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Wir möchten Wuhan Maitville Biotechnology Co., Ltd für die Unterstützung bei den Metaboliten- und Bioinformatikanalysen danken.

Die Arbeit wurde vom Sichuan Traditional Chinese Medicine Development Service Center – Major Project of Traditional Chinese Medicine Industry Development (Neuntes Paket) (Nr. 510201202109711), dem National Interdisciplinary Innovation Team of Traditional Chinese Medicine (Nr. ZYYCXTD-D-202209) und Key unterstützt F&E-Projekte des Sichuan Science and Technology Plan (Nr. 2022YFS0582 und 2020YFN0152).

Staatliches Schlüssellabor für charakteristische Ressourcen der chinesischen Medizin im Südwesten Chinas, Chengdu, 611137, China

Qinghua Wu, Cuiping Chen, Xulong Huang, Xinglong Zhu, Tao Zhou, Jiang Chen, Jie Yan, Feiyan Wen und Jin Pei

School of Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, Chengdu, 611137, China

Qinghua Wu, Qi Yan, Lan Jiang, Cuiping Chen, Xulong Huang, Xinglong Zhu, Tao Zhou, Jiang Chen, Jie Yan, Feiyan Wen und Jin Pei

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WQH und YQ haben gleichermaßen zu diesem Manuskript beigetragen. WQH und YQ haben das Experiment entworfen; Das WQH führte die Probenentnahme, Probenvorbereitung und die Experimente durch; YQ analysierte die Daten und schrieb das Manuskript; JL half bei der Datenkuratierung und dem Verfassen des Manuskripts. CCP, HXL, ZXL, ZT, CJ, YJ, WFY und PJ trugen zur Verbesserung des Manuskriptinhalts bei. Alle Autoren gaben ihre endgültige Zustimmung zur Veröffentlichung.

Korrespondenz mit Feiyan Wen oder Jin Pei.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Wu, Q., Yan, Q., Jiang, L. et al. Die Metabolomik-Analyse zeigt Metabolitenveränderungen während der Gefriertrocknung und Ofentrocknung von Angelica dahurica. Sci Rep 13, 6022 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-32402-0

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Eingegangen: 29. Mai 2022

Angenommen: 27. März 2023

Veröffentlicht: 13. April 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-32402-0

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